Sur l'étiquette d'une bouteille de sirop de menthe, on peut lire les indications suivantes : Sucre, eau, sirop de glucose-fructose, arôme naturel de menthe, colorants : E102 - E131. La chromatographie permet de séparer et d'identifier les espèces chimiques d'un mélange. Elle est basée sur leur différence d'affinité pour deux phases : la phase stationnaire, ou phase fixe et la phase mobile appelée éluant et constituée d'un mélange de solvants.
On ne peut pas réaliser directement la chromatographie du sirop de menthe à cause de la présence des sucres. On procède alors en deux étapes :
Étape 1 : Extraction des Colorants
Des brins de laine écrue (c'est-à-dire non teintée) sont trempés dans une solution d'ammoniac pendant quelques minutes, puis ils sont rincés et séchés. Ils sont ensuite placés dans un bécher contenant du sirop de menthe. Les colorants contenus dans le sirop se fixent, à chaud et en présence d'acide éthanoïque, sur les brins de laine. Après rinçage et essorage, les brins de laine teints en vert sont placés dans une solution d'ammoniac où ils se décolorent. La solution verte obtenue est portée à ébullition afin de la concentrer par évaporation d'eau. Cette solution est ensuite analysée par chromatographie.
Étape 2 : Chromatographie
Sur un papier filtre, on réalise les trois dépôts suivants :
- colorant alimentaire E102 (tartrazine)
- colorant alimentaire E131 (bleu patenté V)
- solution verte obtenue S
L'éluant utilisé est une solution de chlorure de sodium de concentration égale à 20 . Le chromatogramme obtenu est schématisé ci-contre.
Données :
| E102 | E131 | |
|---|---|---|
| Solubilité dans une solution de chlorure de sodium | faible | importante |
Questions :
- Une révélation du chromatogramme est-elle nécessaire ? Pourquoi ?
- Le chromatogramme est-il en accord avec les indications portées sur la bouteille de sirop ? Justifier la réponse.
- À partir des données, proposer une interprétation de la disposition relative des taches sur le chromatogramme.
Partie I : Réponses
- Les taches obtenues étant colorées, une révélation du chromatogramme est inutile.
- Le centre de la tache jaune est à la même hauteur que le centre de la tache jaune du colorant E102 (jaune tartrazine), produit de référence. Pour une même phase fixe et pour un même éluant, deux espèces identiques migrent à la même hauteur. Ainsi la solution verte S contient le colorant E102. Le même raisonnement pour la tache bleue indique que la solution verte S contient aussi le colorant bleu E131 (bleu patenté). Le chromatogramme est en accord avec les indications de l'étiquette.
- La tache bleue a migré plus haut que la tache jaune sur le papier filtre. La disposition des taches est due à la différence de solubilité des colorants avec l'éluant. En effet, plus un colorant est soluble dans l'éluant (ici, la solution de chlorure de sodium), plus il est entraîné par l'éluant et plus il migre haut.
Dosage des Colorants par Spectrophotométrie
Pour déterminer la concentration en colorant jaune et en colorant bleu dans le sirop, on réalise les expériences suivantes à partir du sirop de menthe dilué dix fois, d'une solution de tartrazine à et d'une solution de bleu patenté V à . À l'aide d'un spectrophotomètre, on obtient les courbes donnant l'absorbance A en fonction de la longueur d'onde pour les trois solutions. Les courbes obtenues pour les colorants sont représentées sur les figures 1 et 2 ci-contre et celle obtenue pour le sirop de menthe dilué est représentée sur la figure 3. On réalise ensuite une échelle de teintes à partir des solutions de colorants. On mesure l'absorbance de chaque solution à l'aide du spectrophotomètre en se plaçant à la longueur d'onde pour la tartrazine et à la longueur d'onde pour le bleu patenté V. On obtient les graphiques , figure 4, pour chaque colorant alimentaire, c étant exprimée en .
Questions :
- Pourquoi choisit-on de se placer à la longueur d'onde plutôt que 425 nm pour réaliser le dosage par étalonnage de la tartrazine dans le mélange ?
- À partir des figures 3 et 4, déterminer graphiquement la concentration massique en colorants jaune et bleu dans le sirop dilué. On fera apparaître clairement les constructions sur les graphiques. En déduire les concentrations massiques en colorant tartrazine cmT et en colorant bleu patenté cmB dans le sirop.
Partie II : Réponses
- Pour réaliser le dosage par étalonnage de la tartrazine dans le mélange, il faudrait se placer à une longueur d'onde qui correspond au maximum d'absorbance pour le colorant jaune, soit 425 nm. Or à cette longueur d'onde, on constate que le colorant bleu absorbe légèrement. La mesure serait la somme des absorbances dues aux deux espèces colorées. Il faut donc choisir une longueur d'onde proche de (425 nm) mais pour laquelle l'absorbance du colorant bleu soit nulle. La longueur d'onde nm vérifie ces deux conditions contrairement à la longueur d'onde nm (absorbance du bleu patenté non nulle).
- À partir de la courbe d'étalonnage par lecture graphique, pour , on a Cm(colorant bleu) égale à on a : . Le sirop de menthe ayant été dilué 10 fois, on a finalement : .
Chromatographie sur Colonne : Une Alternative
La technique de chromatographie sur colonne repose sur le même principe que la chromatographie sur couche mince : les espèces chimiques à séparer sont plus ou moins entraînées par un éluant sur une phase fixe. La phase fixe est un solide, le plus souvent de la silice ou de l'alumine remplissant une colonne. L'échantillon est déposé en haut de la colonne. La séparation des espèces chimiques est obtenue par l'écoulement continu d'une phase mobile ( l'éluant ) à travers la colonne. La séparation est basée sur une différence de vitesses d'entraînement des espèces chimiques vers le bas de la colonne.
L'objectif de ce TP est donc de séparer les constituants colorés d'un sirop de menthe ( colorants alimentaires : le E102 et le E131 ) puis de montrer l'intérêt de la chromatographie sur colonne vis à vis de la chromatographie sur couche mince.
Il existe plusieurs chromatographies. En voici des exemples :
- Chromatographie d'adsorption : La chromatographie sur couche mince (CCM) et la chromatographie sur colonne sont des chromatographies d'adsorption ; elles sont basées sur la différence d'adsorption sur la phase stationnaire ; des espèces à séparer entraînées par l'éluant. La phase stationnaire est solide (silice ou alumine).
- Chromatographie de partage : La chromatographie sur papier est une chromatographie de partage basée sur la différence de solubilité des espèces à séparer. La phase stationnaire est formée par l'eau liée aux molécules de cellulose du papier.
Méthode de Chromatographie sur Colonne pour la Séparation des Colorants Alimentaires du Sirop de Menthe
I : Préparation de la colonne
L'opération de remplissage de la colonne conditionne l'efficacité de la séparation. Il ne faut pas qu'il y ait de bulles ou de zone sans phase stationnaire car on aurait alors des chemins préférentiels nuisant à une bonne séparation des composés. Pendant la phase d'élution avec le solvant, on veillera également à ne pas assécher la partie supérieure de la phase fixe.
- Fixer verticalement la colonne à l'aide d'une pince.
- Déposer un petit morceau de coton dans le bas de la colonne.
- Déposer un peu de sable pour rendre la surface plane.
- Peser environ 5g de silice et délayer dans l'eau salée pour en faire un gel.
- Introduire la silice dans la colonne.
- Tapoter la colonne afin d'obtenir une surface plane de silice : rajouter un peu de sable pour aplanir.
- Placer un bêcher sous la colonne.
- Introduire doucement de l'eau salée ( à l'aide d'une pipette plastique par écoulement de long de la paroi de la colonne ).
- Ajouter une quantité d'eau suffisante pour être environ à 2 cm au dessus de la surface plane de la silice.
II : Dépôt de l'échantillon à préparer
- Déposer très doucement à l'aide d'une pipette, sans toucher les parois de la colonne, 5 gouttes de sirop de menthe : attention à ne pas déformer la surface de la phase stationnaire pendant cette opération.
- Lorsque le sirop de menthe a pénétré la surface de la phase stationnaire, éluer avec l'eau salée en remplissant la colonne doucement à la pipette plastique.
- Lorsque le premier colorant arrive en bas de la colonne le récupérer dans un premier erlenmeyer.
- Éluer ensuite avec un autre éluant : alcool à 95°.
- Lorsque le second colorant parvient en bas de la colonne, le récupérer dans un second erlenmeyer.
REMARQUE : Un bêcher « poubelle » doit vous servir à récupérer les liquides indésirables.
Analyse Spectrophotométrique des Colorants
À l'aide d'un spectrophotomètre, on souhaite tracer les spectres d'absorption A = f( lambda ), du sirop de menthe et des 2 colorants issus de la séparation précédente. Une dilution des solutions obtenues est nécessaire pour ne pas dépasser la valeur maximale mesurable par le spectrophotomètre. L'analyste au spectromètre permet d'analyser le spectre d'absorption d'un élément et ainsi déterminer sa composition moléculaire.
Réalisation des Mesures
Le réglage du zéro se fera sur de l'eau distillée en transmittance ( 100% ). Passer ensuite en absorbance. Il est indispensable de faire le banc pour toutes les longueurs d'ondes. On fait varier la longueur d'onde entre 400 et 720 nm en relevant les valeurs de l'absorbance tous les 10 nm ou 20 nm et en rentrant les valeurs au fur et à mesure dans le tableau ci-dessous.
Vous allez créer ce tableau dans le tableur-grapheur (type Excel). On créera pour cela les variables « lambda », « Av », « Aj » et « Ab » puis on rentrera au clavier les valeurs mesurées.
Tableau des Absorbances
| λ (nm) | 400 | 420 | 440 | 460 | 480 | 500 | 520 | 540 | 560 | 580 | 600 | 620 | 640 | 660 | 680 | 700 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Aj | 1,17 | 1,31 | 1,24 | 0,79 | 0,24 | 0,03 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ab | 0,22 | 0,17 | 0,14 | 0,12 | 0,1 | 0,09 | 0,1 | 0,11 | 0,15 | 0,22 | 0,29 | 0,48 | 0,56 | 0,23 | 0,04 | 0,01 |
| Av | 1,67 | 1,88 | 1,8 | 1,56 | 0,4 | 0,05 | 0,01 | 0,03 | 0,08 | 0,17 | 0,24 | 0,45 | 0,54 | 0,2 | 0 | 0 |
Tracer à l'aide de l'assistant graphique, les 3 courbes sur le même diagramme. Interpréter les courbes obtenues. Sont-elles conformes à ce que l'on pouvait prévoir ? Interpréter chacune d'elle. On remarque que la courbe correspondant au jaune et celle correspondant au bleu possède seulement un pic : on détermine ainsi leur longueur d'onde et leur couleur par la même occasion. Celle correspondant au vert possède quand à elle, deux pics situés aux mêmes endroits que ceux du jaune et du bleu. On en déduit que le vert est un composé de bleu et de jaune.
Questions d'Entraînement
Sur la méthode que nous venons de voir, voici quelques questions qui vous aideront à vérifier que vous avez bien compris le principe.
- Quelle est la phase stationnaire ? Quelle(s) est(sont) la(les) phase(s) mobile(s) ?
- Quelle est la couleur du premier colorant extrait ? Proposer une méthode pour l'identifier.
- Le deuxième colorant est le E131. Quelle est sa couleur ?
- Quel est le colorant qui est le plus adsorbé par le gel de silice ?
- Quel est celui qui présente le plus d'affinité avec l'eau salée ?
- Pourquoi avoir changé d'éluant pendant la chromatographie ?
- Quel est l'intérêt de ce type de chromatographie par rapport à celle sur couche mince ?
Réponses aux Questions d'Entraînement
- La phase stationnaire correspond au gel de silice. Les deux phases mobiles sont les deux éluants ( eau salée + alcool à 95° ).
- Le premier colorant extrait est le jaune ( E102 ). On pourrait mesurer l'absorbance à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Le E131 correspond au colorant bleu.
- Le colorant le plus adsorbé par le gel de silice est le bleu ( E131 ).
- Celui qui présente le plus d'affinité avec l'eau salée est le jaune ( E102 ).
- Le bleu ne présentait aucune affinité avec l'eau salée. Nous ne serions ainsi pas parvenu à l'extraire correctement.
- Le type de chromatographie sur colonne permet de récupérer les deux colorants. Celle sur CCM les sépares simplement.
Exercice de Type BAC : Traitement d'une Infection Virale
Pour une infection provoquée par le virus Influenza, deux types de traitements peuvent être prescrits aux patients : les traitements symptomatiques tels que les antipyrétiques (paracétamol, ibuprofène, …) et les traitements antiviraux (oséltamivir, zanamivir,…). Dans un laboratoire, on reçoit deux comprimés : l’un étant de l’ « ibuprofène 100 mg » et l’autre de l’« oséltamivir 75 mg ». Ces médicaments contiennent un principe actif différent et d’autres espèces chimiques appelées excipients. Le principe actif est l’espèce chimique utile au traitement. Par exemple, pour le comprimé « ibuprofène 100 mg », il s’agit de l’ibuprofène. Dans cet exercice on se propose de vérifier l’identité des deux comprimés, puis de réaliser le dosage pH-métrique de l’ibuprofène et enfin d’étudier quelques propriétés de l’oséltamivir. Il existe des multitudes de virus. Malgré les avnacées de la médecine, nous ne savons toujours pas les soigner mais juste atténuer leurs effets.
1. Identification des Comprimés d’Ibuprofène et de l’Oséltamivir
1.1. Analyse chromatographique
On réalise une chromatographie sur couche mince des deux comprimés reçus que l’on nomme arbitrairement A et B. L’éluant est un mélange complexe de solvants organiques. Identifier, en justifiant les réponses, les deux comprimés A et B à partir du chromatogramme représenté en figure 1.
1.2. Principe actif
Données : Masse molaire de l’ibuprofène : Mi = 206 g.mol-1 ; Masse molaire de l’oséltamivir : Mo = 312 g.mol-1 .
- La masse du comprimé d’ «ibuprofène 100 mg » est de 300 mg. Celle du comprimé d’« oséltamivir 75 mg » est de 225 mg. Expliquer la différence entre les masses annoncées et les masses mesurées.
- Déterminer la quantité de matière de principe actif contenu dans le comprimé d’ «ibuprofène 100 mg ».
- Calculer la masse d’oséltamivir correspondant à la même quantité de matière.
- Les deux comprimés contiennent-ils la même quantité de matière de leur principe actif ? Justifier.
2. Dosage pH-métrique de l’ « ibuprofène »
On souhaite vérifier la masse d’ibuprofène présente dans un comprimé. L’ibuprofène a été synthétisé pour la première fois dans les années 1960. Sa formule cor...
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